兵庫県立大学 大学院生命理学研究科 生命科学専攻
日下部岳広

１．はじめに
　小学校に上がる前から生き物と図鑑が大好きで、畳の上に図鑑を何冊も並べては比べ読みしていた（その割に大して物知りではないが）。専門的な昆虫採集はどうやったらいいのかよくわからなくてやらなかったけれども、動物、植物、いろいろと採ってきては、図鑑と比べていた。生まれ育った場所が飛騨の山の中で、家の前の谷でイワナが網で捕れるような環境だったのは、とても幸運だったと思う。図鑑ではよく似た生物どうしが目や科といったグループに分類されていることが面白く、地質年代と系統樹が描かれた図版に興味を覚えた。生きた化石とよばれる生物が特に魅力的だった。家の周りで採集したカマキリそっくりのカマキリモドキやスナヤツメの幼生も、進化への好奇心をかき立ててくれた。生物の多様性とそれを生み出した進化への興味が私の研究の根本で、それは子どもの頃の興味の延長のように思う。

　金沢大学理学部では、当時は分子生物学をやっている研究室はなかったのだが、生態学、系統分類学、生理生化学、発生学などの講義や実習はどれも楽しかった。なかでも、能登臨海実験所や瀬戸臨海実験所での磯採集やドレッジ採集で、（山奥育ちなので）図鑑でしかみたことがなかったいろいろな海産無脊椎動物の採集・観察には特に夢中になった。大滝哲也先生が、発見されてまだ日も浅かったホメオボックスと体節性との関係の話をされ、櫻井勝先生がいろいろな動物の変態や発生と遺伝子発現制御の関係について話をされたのを聞いて、発生学に興味をもった。動物の発生を分子生物学的に研究してみたいと思っていたところ、雑誌『遺伝』に京都大学理学部の西方敬人さんと佐藤矩行先生が書いたホヤの発生研究の解説文に出会い、それがきっかけで大学院は京都大学に進学した。
 

２．ホヤ幼生の筋肉アクチン遺伝子に関する研究
　修士２年になって、念願の佐藤矩行先生の研究グループに入れてもらい、「悪いけど（？）アクチンやってくれないか」という佐藤さんの一言で研究テーマが決まった。正直なところ、佐藤さんのもとでホヤの発生研究ができるだけで満足だったのと、卒研、修士１年と、ネガティブデータの積み重ねで、何でもいいから腰を落ち着けて取り組んで、自分がやったのだと言える成果を出すことが先決だ、という思いがあった（もっと正直に言うと、本当はホメオボックス遺伝子やMyoDのような“カッコいい”発生調節遺伝子の研究にあこがれていた）。研究室はスタッフが佐藤さん１人、博士課程の学生はゼロで、学振ポスドクの真壁和裕さんが唯一の先輩だった。真壁さんには、分子生物学実験を一から教えていただいた。

　研究テーマは筋肉アクチン遺伝子の発現調節からホヤ卵の細胞質にある筋肉分化決定因子にまで遡ろうというものであった。まずは筋肉アクチン遺伝子をクローニングしなくては始まらない。マボヤのゲノムDNAライブラリーを作ることが最初の目標となった。分子生物学の研究室では当たり前のことが、何をやってもなかなかうまく行かず、結局、修士課程も終わりに近付いた12月27日にようやくライブラリーが完成した。まだ何かデータを出した訳ではなかったのだが、初めて自分で何かできたという実感が得られた瞬間で、今でも日付を覚えている。

　ライブラリーが出来て、筋肉アクチン遺伝子を単離したところ、マボヤのゲノムには少なくとも７つの筋肉アクチン遺伝子があって、５つは染色体上でタンデムに並んだクラスターを、残りの２つも染色体の別の場所で頭を向かい合わせに並んだクラスターを作っていることが判明した1,2)。調べてみると、７つの遺伝子すべてがホヤ幼生の尾の筋肉細胞で発現していた2,3,4)。一つのゲノムにこれほどたくさんの筋肉アクチン遺伝子が存在する例は、他にあまり知られていない5)。全ゲノム配列が解読されて、カタユウレイボヤにも多数の幼生筋アクチン遺伝子が存在することが分かった。ホヤは胚発生に要する時間が短いうえに、アクチンは筋肉細胞の中でも最も分子数が多いタンパク質である5)。ホヤ幼生の筋肉分化には短時間に多量のアクチンが供給される必要があり、遺伝子クラスターはその解決方法として進化してきたのであろう6,7)。

　大学院で同学年の彦坂暁さんがホヤ胚に外来遺伝子を導入する方法の開発に取り組んでいた。クローニングした筋肉アクチン遺伝子の上流領域をレポーター遺伝子につないだ融合遺伝子を、マボヤ卵にマイクロインジェクションしたところ、みごとに筋肉だけでレポーター遺伝子の発現がみられた8)。ホヤの遺伝子発現調節領域を初めて同定した実験である。この実験方法で調べたところ、７個のアクチン遺伝子はどれも100塩基対ほどの短いプロモーター領域だけで筋肉特異的に発現することが分かった2,9)。その後、筋肉アクチン遺伝子の転写調節領域を利用して、筋肉分化の分子メカニズムの解明が進んだ10)。また、発生における転写調節研究のモデルとしてのホヤの基盤づくりにも貢献することができたと思う。
 

３．尾をもたないホヤ幼生の進化
　アクチン遺伝子クラスターを報告した論文1)の別刷を関連分野の研究者に送ったところ、カリフォルニア大学ボデガ臨海実験所のWilliam R. Jeffery教授から手紙をいただいた。ポスドクに来ないか、という内容だった。まだ博士課程２年だったので、佐藤さんと相談して「いますぐポスドクにはなれないが、学位を取る前にプレドク（？）としてそちらで研究をしたい」という返事をしたところ、半年間Jeffery研で研究をさせてもらえることになった。

　Jeffery博士は一部のホヤにみられる無尾幼生の発生を研究していた。モルグラ属のホヤでは近縁な２種間でも、片方はオタマジャクシ幼生、もう一方が無尾幼生の場合がある。しかし変態後の成体は互いにそっくりである。無尾幼生は筋肉や脊索をもたない。近縁種なので、わずかな遺伝的差異が幼生形態の大きな違いを生み出していると期待される。形態進化のしくみを調べる格好のモデルである。私は、筋肉アクチン遺伝子が無尾幼生ではどうなっているかを調べることにした。調べたのはMolgula oculata（オキュラータ）とMolgula occulta（オカルタ）というフランス産のホヤで、オキュラータが有尾、オカルタが無尾である。実験とサンプリングのために、夏の間はフランス・ブルターニュ地方のロスコフという町で過ごした。

　有尾のオキュラータのアクチン遺伝子がマボヤやユウレイボヤとは違っていた11)。幼生の筋肉で発現するアクチン遺伝子が１つしかないのである。無尾のオカルタでは、筋肉アクチン遺伝子のコード領域にフレームシフトやストップコドンが生じて機能が失われていた11)。面白いことに、機能を失った無尾のアクチン遺伝子の転写調節領域をレポーター遺伝子につないで、有尾のホヤ胚に入れると、筋肉細胞で特異的に発現した。コード領域は壊れていたが、プロモーターはまだ生きていたのである。さらに予想外だったのは、有尾のアクチン遺伝子のプロモーターを無尾の幼生に入れた実験結果だ。無尾幼生には尾の筋肉になる系譜の細胞は残っていて、レポーター遺伝子はそれらの筋肉細胞で特異的に発現した。つまり筋肉特異的な遺伝子発現に必要な転写因子は、無尾幼生の筋肉系統の細胞に存在しているのである。これらの結果から、筋肉がつくられない原因は筋分化に関わる転写因子ではなくて、アクチンなど筋肉を構成するタンパク質の遺伝子が変化したことによると考えられた11,12)。機能的な筋肉特異的転写因子が無尾幼生の筋肉系統の細胞に存在することは、後の別の研究によっても示されている13)。また脊索についても、機能的なBrachyury遺伝子が無尾幼生の発生過程で発現することが示されている14)。

　アクチン遺伝子の変異は、尾および筋肉がつくられなくなった原因なのであろうか。その可能性は高いと考えている。そもそもオキュラータとオカルタは同じ場所に同じように生息している。尾がなくてもオカルタが問題なく生きていける環境でオキュラータの尾の必要性は低いのかも知れない。マボヤやユウレイボヤにはたくさんある尾の筋肉のアクチン遺伝子が、オキュラータには１つしかないことは、筋肉の必要性の低下に伴って遺伝子が失われ、必要最小限の数に絞られた結果と考えることもできる。分子系統樹によりモルグラ属の系統関係を調べてみると、無尾幼生は独立に何度も生じたことが分かった12)。Molgula bleizi（ブライジ）はオカルタよりも“新しい”無尾種で、分化した筋肉細胞はもたないが、不完全な脊索を備えた短い尾をもつ。ブライジのアクチン遺伝子もやはり変異により機能が失われていたが、変異の場所がオカルタとは全く異なっていた12)。ブライジとオカルタはそれぞれ独自に筋肉アクチン遺伝子の機能を失ったようである。このアクチン遺伝子は幼生の筋肉に特異的であり、成体の筋肉では別のアクチン遺伝子が使われている。したがって、幼生筋特異的アクチン遺伝子が失われても他の組織には全く影響を与えない。幼生筋アクチン遺伝子が減少して１コピーになったことにより、無尾幼生が進化しやすい状況がつくられた可能性がある。つまり、モルグラ属で無尾幼生が何回も独立に生じてきたことの要因の１つがアクチン遺伝子という訳である15)。

　形態進化の原因として、転写因子やシグナル分子など、いわゆる発生調節遺伝子の発現パターンや機能の変化が重要であるとする考え方は、魅力的であり、エボデボ（evo-devo）研究の多くはそのような考えに基づいて行われてきた。しかし多くの場合において、発生調節遺伝子ではなくその下流に位置する遺伝子群の変化が形態進化の一義的な原因なのではないだろうか15)。Stedmanらの最近の研究16)はそのような変異がヒトの進化においても重要であったことを示唆している。全ゲノム配列の解読やマイクロアレイの活用などゲノム科学の進展により、今後、そのような例が多くみつかってくるであろうと期待している。
 

４．ホヤの感覚器・神経系の発生と進化
　Jeffery研でポスドクとして１年半過ごした後、北海道大学で鈴木範男先生の研究室の助手になり、メダカのグアニル酸シクラーゼについての研究を行った17,18,19,20)。グアニル酸シクラーゼには網膜や松果体、嗅細胞で特異的に発現するものがあり、その研究を通して、感覚器官や神経系の発生に興味をもつようになった。2000年に姫路工業大学（現：兵庫県立大学）の津田基之先生の研究室に移り、現在までホヤの感覚器・神経系に関する研究に取り組んでいる21,22,23,24,25,26)。

　脊椎動物に比べるとはるかに単純とはいえ、ホヤの脳神経系は種々のタイプの細胞からなり、それらが複雑なネットワークを形成している。研究に着手した当時、ホヤの神経系研究は、他の組織・器官に比べ遅れていた。神経系の各種細胞を識別できなかったことが大きな原因である。遺伝子発現プロファイル解析27)とゲノム情報の解析により多数の細胞特異的マーカーを得ることに成功し、現在ではホヤ幼生の神経系のほとんどの細胞タイプを識別することが可能になった21,24)。これらを基に各神経細胞タイプに特異的なプロモーターを初めて同定した。これらのプロモーターは、発生・転写制御研究だけでなく、神経回路解析や行動解析に使われ、ホヤ脳神経系研究の強力な武器となっている10)。

　ホヤ幼生の脳には眼点と平衡器と呼ばれる２つの感覚器が存在する。いずれもメラニン色素細胞を１個含むので、実体顕微鏡で観察すると透明な幼生の頭（胴体）の中に黒点が２つあって、簡単に識別できる。眼点と脊椎動物の眼の関係に興味があり、そこで発現するロドプシンの遺伝子（オプシン遺伝子）を単離した21)。脊椎動物と無脊椎動物の眼で違ったサブファミリーのオプシン遺伝子が使われているのだが、ホヤの眼点には脊椎動物型のオプシン遺伝子Ci-opsin1が発現していた。このオプシンが眼点の光受容に関わっていることは、遺伝子ノックダウンと行動解析実験を組み合わせることにより証明できた26)。

　脳の一部である松果体（および副松果体）も、哺乳類以外の多くの脊椎動物では光受容器としての機能を備えている。ホヤ幼生の眼点はいくつかの点で松果体に似ている。脳の一部であること、神経板の左右両側に原基があること、個体発生において最初に機能する光受容器であること、その光受容が幼生にもたらす行動が似ていること、などである。はたして眼点は松果体と相同なのだろうか。もしホヤに眼点以外に光受容器があって、それが脊椎動物の側眼（いわゆる眼）と共通の性質をもっていれば、ホヤにも形は違うけれども眼と松果体のそれぞれに相同な光受容器があるといえるかもしれない。実は、カタユウレイボヤのゲノムにはCi-opsin1とよく似たオプシン遺伝子がもう１つ存在する。Ci-opsin2と名付けたその遺伝子の解析からホヤ幼生がもつ新奇な光受容器を発見した（投稿準備中）。この新奇光受容器は、発生上の起源が脊椎動物の側眼とよく似ている。眼と松果体の起源は、ホヤと脊椎動物の共通祖先がもっていた別々の光受容器にまで遡ることができる可能性がある。
 

５．コンピューターを使った転写調節領域の比較解析
　京大ではクラスターを作っている複数のアクチン遺伝子の転写調節領域を比較し、Jeffery研では近縁種のアクチン遺伝子のプロモーターを比較、北大ではメダカで発現パターンが少しずつ違う組織特異的遺伝子ファミリーの発現調節領域を比較した19,20,28)。種間、組織間、遺伝子間を問わず、比較という手法はメカニズムや進化について多くのことを教えてくれる。北大にいるころ、もっと大規模に多数の遺伝子を比較すれば、個々の遺伝子の解析ではみつけられないことが分かるのではないかと思ったが、実際には簡単にそのような解析ができるとは思えなかった。ところがゲノムプロジェクトも動きだし、ホヤの神経系で発現する遺伝子がたくさんみつかってきたので、「比較の虫」が疼いてきて、いてもたってもいられなくなった。幸い科研費のサポートをいただき、多数のホヤ遺伝子の転写調節領域を実験とコンピューターによって解析する研究プロジェクトに着手した。

　発現パターンのよく似たカタユウレイボヤの遺伝子をたくさんあつめて、転写調節領域に共通にみられる配列を探すという単純な発想である。最初はcDNAの情報を頼りにPCRでゲノムDNAのウオーキングをして、遺伝子上流領域を得ていたが、全ゲノム配列が使えるようになって、格段にやりやすくなった。さらに近縁種ユウレイボヤのゲノム配列も使えるようになったので、解析には種間比較も取り入れた。いくつかの組織で共通モチーフをみつけることに成功し、in vivoの検証実験により、シスエレメントであることを証明した10,29)。ほぼ同時に米国の２つの研究チームも情報科学的解析と検証実験を組み合わせてホヤゲノムの転写制御配列を探索した論文30,31)をそれぞれ発表した。幸い、米国のチームとはストラテジーも違い、結果もユニークなものであった。立ち上げには時間がかかったが、まだ研究は始まったばかり。これからが楽しみである。
 

６．遺伝子ファミリーと脊索動物の系統関係
　ホヤなどの尾索動物とナメクジウオ（頭索動物）は脊椎動物にもっとも近縁な無脊椎動物と考えられ、脊椎動物と同じ脊索動物門に分類されている。では、ホヤとナメクジウオのどちらが脊椎動物により近縁なのだろうか。一般的にはナメクジウオの方がより脊椎動物に近縁と考えられているようである。しかし、そのことを明瞭にサポートする分子系統学的な研究結果は、実はこれまであまり報告されていない。私は筋肉アクチンと視物質オプシンのそれぞれについて、他の無脊椎動物にはない、脊椎動物型のアイソフォームがホヤに存在することを示した3,4,21,32)。このことは、ホヤの筋肉や光受容器と脊椎動物の器官との相同性を示唆するとともに、ホヤ類と脊椎動物との近縁性を分子レベルで明確に示したものである。分子系統学的解析の結果は、ホヤの筋肉アクチンと視物質オプシンはどちらも、ナメクジウオのものよりも脊椎動物のものに近いことを明瞭に示している21,33,34,35)。カドヘリンファミリーも、ナメクジウオにはない脊椎動物型の分子がホヤに存在しているようである36)。しかし、この問題に対するより確かな答えを得るためには、ホヤとナメクジウオ、それぞれのゲノムがコードする情報を幅広く比較する必要があるだろう。
 

７．おわりに
　学部、修士、博士（修士２年から）、ポスドク、助手、助教授と研究室を移り、そのたびに研究テーマを変えてきた（変えざるを得なかった）。しかし、Dobzhanskyの言葉“Nothing in biology makes sense except in the light of evolution”の通りで、どの対象からも自分が面白いと思うことをみつけることができた。振り返ってみると、そのどれもが自分の中では関連しあい、現在の研究につながっている。

　最後になりましたが、私を研究者として育ててくださいました佐藤矩行先生、William R. Jeffery先生にこの場を借りて厚くお礼申し上げます。研究室を離れて後も、両先生には暖かい助言をいただき、励まされてきた。佐藤先生とJeffery先生の研究者としてのあり方は私にとっての道標でありつづけている。西田宏記博士、西方敬人博士、真壁和裕博士、藤原滋博士をはじめとする佐藤研の先輩方や友人たちからも多くを学ばせていただいた。ゲノムプロジェクトとcDNAプロジェクトによりカタユウレイボヤの遺伝子研究は質的に変貌をとげ、私の研究はその多大なる恩恵を被っている。佐藤矩行先生とともにこれらのプロジェクトに尽力された佐藤ゆたか博士に敬意を表します。津田基之先生は私が姫路工業大学に着任する数年前から、ホヤの脳神経系の研究を開始されていた。最初からホヤの採集・飼育の態勢が整い、充実した研究設備のなかでホヤの感覚器・神経系の研究を始めることができたのは大変幸運であったと思う。津田先生には、私の希望する研究ができるよう物質的にも精神的にも支援をいただいている。最近の研究は、中川将司博士、日下部りえ博士、吉田麗子氏、川上功氏、堀江健生氏、宮本由紀氏、池田洋子氏らの協力に支えられてきた。これら共同研究者の皆様にお礼申し上げます。
 

参考文献

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