トピックス■ウニ精子鞭毛へのマイクロ電気穿孔

高尾大輔(基生研・時空間制御)、上村慎治(中大・理工・生命)


Zoological Science Award 2011受賞論文

Single-cell electroporation of fluorescence probes into sea urchin sperm cells and FRAP analysis.
Daisuke Takao and Shinji Kamimura
Zoological Science 27(5): 279-284, 2010.

 真核生物の鞭毛・繊毛は、昆虫の精子や中心小管のない哺乳類の一次繊毛などの例外はあるものの、多くが共通する9+2構造を持つことが特色である。9本の周辺微小管(ダブレット微小管)が中心小管(2本のシングレット微小管)を取り囲む形をしていて、この構造を軸糸とよぶ(Fig. 1)。周辺微小管上には一定周期の突起構造があり、これがモータータンパク質のダイニンである。軸糸の断面で見ると、ダイニンは内側と外側の二列に並び、それぞれダイニン外腕、ダイニン内腕とよばれる。ダイニンはATPを加水分解し、隣接する周辺微小管との間で滑り運動をおこなう。これが鞭毛・繊毛の屈曲運動の原動力となる。アメーバ、酵母や高等植物など、進化の過程でこの9+2軸糸構造をまったく失ったグループはいるが、他の多くの真核生物で共通する点、また、クラミドモナスと哺乳類など、大きくかけ離れたグループ間でも、構成タンパク質や制御機構など多くの類似性が見られることから、単細胞の時代、真核生物が誕生した当初から備わった重要なオルガネラであると考えられる。ミトコンドリアを持っていることと同じように、鞭毛・繊毛を持つことが、初期の真核生物が適応拡散し得た重要な特性であったのかも知れない。
Fig.1 繊毛・鞭毛構造を示す模式図。
 
 棘皮動物の精子は、直径3 μmほどの頭部と40〜50μmの長さの鞭毛を持ち、平面的な鞭毛打運動を行うので、光学顕微鏡で観察しやすく、鞭毛の運動機構を調べる実験材料として長らく使われてきた。古くは、Gray & Hancock [1]、Lighthill [2], Johnson & Brokaw [3]などの流体力学的な研究、Hiramoto & Baba [4]らの詳細な運動波形解析、トリトンモデルの開発から種々の生理条件下での運動活性を調べたGibbons [5-6]やBrokaw [7-9]らの研究などの歴史がある。ウニ精子鞭毛はマイクロマニピュレーションの操作も可能なサイズで、この技術を使った研究に関しては日本人の貢献も大きい[10-13]。私たちは、鞭毛内部のATP拡散速度と運動維持機構に関して、次のような仮説を立てて研究を進めることにした。二つは、正反対の命題なので、いずれかが正しいはずであろうという発想である。

・ウニ精子鞭毛運動ではATP供給速度が律速となっている。遊泳運動のために効率の良い最適な長さはもっと長いはずである。
・ウニ精子鞭毛の長さは遊泳効率上では最適なもので、ATP拡散供給の問題は大きな制約条件にはなっていない。

 後述するように、最初の命題に対しては、拡散係数のはっきりとしたデータはなかったが、すでに他の計算シミュレーションがあり[14-16]、鞭毛は100 μmほどが限界長であろうと推測されていた。私たちは、より正確で定量的な裏付けを与えるために、繊毛や鞭毛内部の拡散速度を実際に測定することが重要であると考えた。これには、生物学的に二つの重要な意味がある。一つは、上の命題に示すとおりで、運動のエネルギー源となるATP供給の問題である。真核生物の鞭毛がバクテリアの鞭毛と根本的に異なる点は、細胞の外側にある構造か、細胞の内側にある構造かの違いである。バクテリア型の鞭毛は、細胞の外に露出したスクリューであり、基部の回転モーターを使って駆動するために、エネルギーを先端まで供給する必要はない。消費エネルギーを計算すると、この方がずっと省エネという点では優れている。真核生物は能動的な往復屈曲運動で推進する運動機構を進化させる別の理由があったと想像される。ところが往復運動の場合、基部付近だけでムチ打つような運動では、まったく推進力を生み出すことはできない。これは、微生物の世界では、相対的に粘性力が大きくなるためで、流体力学の大原則である[17]。この物理的な制約のために、真核生物の鞭毛・繊毛は、全体で能動的な往復くねり運動しなければならない。つまり、全長に渡ってエネルギーを枯渇せぬように供給しなければならないことになる。ATPをいかに先端まで効率よく拡散させるかが、課題となったはずである。クレアチンシャトル[18-20]やアデニレートキナーゼ[21]で不足分を補充できるにせよ、もとのエネルギーは、鞭毛基部付近のミトコンドリアからのATP供給に依存している。ウニ精子の場合、鞭毛の中のダイニンは実質濃度が40 μMであり、一回の鞭毛打運動で平均2〜3個のATPを消費するので[6, 22]、1秒に4 mM(40 Hzの運動)、1分で240 mM相当のATPを消費するとんでもないエネルギー浪費家である。ショウジョウバエのように精子全長に渡ってミトコンドリアを配置する、哺乳類精子のように解糖系を活用する[23, 24]という別解が必要であったのは、そのためである。この点で、ATP供給速度と鞭毛運動機構との関係、つまり、拡散速度がどの程度の制約条件となっているかの知見は、繊毛・鞭毛の運動機構の進化を議論する上で重要なポイントである。

 拡散速度を正確に求める二つ目の理由は、シグナル伝達機構を担うアンテナ構造としての繊毛・鞭毛の役割が、近年注目されているためである[25-28]。現在、繊毛病とよばれるヒトの遺伝病の研究が大きく進みつつある。ヒトのほとんどすべての細胞で、細胞周期のある時期に一次繊毛が出現すること、そのことが後の細胞分化をコントロールする上で必須であるとの証拠が数多く得られている。一次繊毛が受容する信号伝達物質や機械的な刺激が、シグナル伝達経路を介して細胞体へと転送され、それが細胞分化の制御に関わると考えられるようになった。シグナル伝達を担うセカンドメッセンジャーがどのような速度で一次繊毛内を拡散移動するのか、シグナル受容機構が繊毛上に配置されている意味は何か。これを理解する上で、実際の拡散速度を明らかにしておく意義は大きい。

 これが、私たちがウニ鞭毛内部の拡散係数を精密に調べる研究をはじめた理由である。細胞内の拡散速度の解析方法には、現在、主に二つの手法、FRAPと一分子解析法がある。FRAP [29-31]は、Fluorescence Recovery After Photobleaching(光褪色後蛍光回復法)の意味で、細胞内に蛍光色素を注入した後、一部を強力な紫外線照射などで急速に退色させて、その後の蛍光回復を見る方法である。神経細胞や培養細胞での解析例がすでに報告されている。レーザー光を二次元走査するか、一点に絞って照射するかの違いだけなので、共焦点蛍光顕微鏡の光学系でも容易に実現できる。現在の汎用型の共焦点顕微鏡にもFRAP観察モードの設定がある機種も多いだろう。しかし、私たちの実験目的には、数msの時間分解能で蛍光強度変化がモニタリングできるが必要があり、一般的な共焦点顕微鏡はこのような高速の解析には使えない。一分子解析では、細胞内に取り込ませる色素の量は微量ですむが、蛍光色素を一分子で追跡する超高感度の撮像系と全反射蛍光照明システムが必要となる。ともに、技術的な難しさはある。私たちはFRAP法を試すことにした。EM-CCDなどの高感度カメラもなく、市販の全反射型顕微鏡がまだ出はじめた頃であった点、また、細胞内に取り込ませやすいAcetoxymethyl化、あるいは、Diacetate化した手軽な蛍光色素[32-34]が入手し易かったためである。


 まず、高尾が、青色のアルゴンレーザー(波長488nm, 5500ASL, DZ Laser Service)を使い1/500秒の短い時間(EC-598, Copal)、光学顕微鏡下(IX-70, Olympus, 対物レンズ, UApo/340/1.35 oil)の試料を直径5 μmの狭い領域で照射する光学系を、ほとんど手作りに近いで形で構築した(Fig. 2)。この照射で種々の蛍光色素の退色操作が可能となった。観察像の記録には、強力なレーザー光照射の間だけ感度を落とし、その前後の蛍光像を高感度で記録するという特殊な画像切り換え操作が必要となる。これはタイマーIC(LM555CN/NOPB, National Semiconductor)を使いデジタル回路を作成し、シャッター機能付きの高感度のIIカメラ(C7787, Hamamatsu Photonics)と高速度ビデオカメラ(200 fps, HAS-200R, DITECT)を組み合わせて画像記録が可能となった(Fig. 3, 4)。
Fig.2 FRAPの実験のための光学系。


 このFRAP実験で、分子量500程度の蛍光色素の拡散係数を精度よく解析でき、速度は水中の拡散(〜300 μm^2/s,)よりも数倍遅いことがわかった(〜60 μm^2/s [35])。鞭毛軸糸の中には、微小管のチューブリンやモータータンパク質以外200-300種類のポリペプチドが密集していて、実質的なタンパク質濃度は、400 mg/ml、濃度は40 %に達する環境である[22]。こういった高濃度の細胞質環境は、Molecular crowding conditions(分子的クラウディング環境)といわれ、たとえゾル状態であっても、物質の自由な拡散や移動は大きく制限されている環境であると考えられる[36, 37]。そのため、数倍程度の拡散係数の低下は、むしろ、想定内で、もっと遅い数値が出てきてもおかしくないとはじめは思っていた。

Fig.3 FRAPでウニ精子鞭毛中ほどの蛍光を退色させた後の回復過程を示す例。蛍光強度は疑似カラーで示してある。



Fig.4 Fig.3の蛍光強度回復過程を高い時間分解能で解析した結果。


 この拡散定数は、通常の培養細胞でも精密に調べた値が少なく、筋細胞では収縮力回復などの生理現象を目安にした推測値しかなかったために(〜150 μm^2/s [38])、これで、はじめて鞭毛内ATP拡散速度を精度良く議論できるようになったのである。計算の方法は、Tombsら[16]がすでに論文発表しており、鞭毛運動によるATP消費を考慮し、クレアチンシャトルによるATPバックアップがあり、精子頭部のミトコンドリアにおけるATP合成が過不足なく起こり数mMの濃度に維持されていると仮定して、ATPが鞭毛先端まで供給されるかどうかを見積もることができる。また、ダイニンモーターの運動活性に必要なATP濃度(おそらくKm値の0.1mM程度)を満たすための鞭毛の限界長も計算できる(Fig. 5)。

Fig.5 鞭毛内拡散係数(60と150 μm^2/sの2種類)をもとに求めた、鞭毛内のATP、ADP、AMP、Cr、PCr濃度とATP加水分解活性(相対値)の予測結果(40と100 μmの二種類の長さで)。


 鞭毛の限界長は、40〜60 μmであることがわかった[35]。精子頭部にあるミトコンドリアの呼吸によってのみエネルギーが供給される系では、これ以上長い鞭毛では、(a)運動速度を落とす、(b)運動時間を短縮する、(c)先端部分の運動はさせないといった、マイナスの対処法でしか問題解決できないはずである。これで生殖戦略の上で問題なければ、動物はこのような選択をするはずである。典型的な例が、魚類の精子で、放精後の数十秒で授精させるという短期決戦型は、この(b)の解決法そのものである[39]。

 分子量のより大きな分子、他の電荷を持った分子、タンパク質などで拡散速度を解析することで、はじめて詳細な鞭毛内拡散の特性が記述できると考えられる。場合によっては、大変混み合った軸糸内部には、侵入しにくい分子、移動しにくい分子などがあることも、他の種類の分子を使ってはじめてわかって来るだろう。そこで、神経細胞での実績のあるマイクロ電気穿孔法(Microelectroporation [40-43])に挑戦することになった(Fig. 6)。この技術をウニ精子に応用する上での予測される問題点は二つある。一つは、海水を使わねばならない点で、細胞の外から電流を流して、効率よく精子細胞に電気穿孔できるかという点である。これは、数多くの実績報告のあるウニやホヤの卵を使った電気穿孔法研究が参考になった。二つ目は、細胞のサイズである。数 μm程度の細胞でも可能であるとの情報は得ていたのであるが、鞭毛はそれより2桁は小さいサイズ(直径0.2 μm)である。その中を電流が流れるのか、大変疑わしかったからである。このような疑念は、はじめて見なければわからない。しかし、ともに大きな問題とはならなかった点で、私たちの実験は、大変幸運であった。最初の課題は、海水の代わりに、細胞内の組成に似せた塩組成の溶液を作成し、浸透圧をマニトールで調整する方法を使った(225 mM K-gluconate, 225 mM mannitol, 20 mM NaCl, 20 mM MgCl2, 10 mM HEPES (pH 7), 0.5%(w/v)BSA)。これは私たちのオリジナルではなく、ウニ胚を使った電気穿孔法の前例にならっただけである[44]。また、細胞のサイズも大きな問題はなかったようである。直接の細胞内注入ではないために細胞サイズの問題はほとんどないことも、私たちの実験の結果として明確にわかった点である[45]。これはマイクロ電気穿孔法の特に優れた点と考えられる。装置も一般的な実習用電気刺激装置で十分代用できること、精子内へ注入できるかどうかの条件は、他の問題、分子サイズ、分子の電荷、膜の特性、電流条件に大きく左右されることもわかった。最終的に蛍光標識したATP分子などは難しく、分子量の大きな蛍光デキストランは不成功であった(Fig. 7, Table I)。拡散係数と分子量との関係はアインシュタイン・ストークスの式、D = kT/6ηπa ∝ 1/(分子量)^(1/3) (ただし、kはボルツマン係数、Tは絶対温度、ηは粘性係数、aは粒子径)で表現されるが、分子量の異なる分子を使うことで、上で紹介した拡散係数の実測値がより確実になる。実測値は予測された通りで、上のATP拡散速度の議論もより確かなものとなった。

Fig.6 ウニ精子鞭毛へのマイクロ電気穿孔法実験の装置の概要。


 このような一連の定量的な解析から、鞭毛内の物質拡散に関して、さらに詳しい状況がわかるようになった。拡散現象を正しく記述する上で、細胞内の拡散係数(D)以外に、細胞形状を考慮する必要があることに気づいたのである。上の式で求まる拡散係数(D)は、分子量、粘性、絶対温度などで決まるもので、濃度勾配と拡散速度との関係を示す明確な物理定数である。しかし、このパラメータの絶対値そのものは、生き物にとってはそう大きな意味を持たないのかも知れない。物質がどのような速度で供給されるか、シグナル分子をどのような速度で運ぶか、不要なものをどれだけ速やかに取り去れるかが生き物にとっては重要である。その速度に直接影響するD以外の重要な因子が細胞の形状であることがわかってきた。
Fig.7 ウニ精子鞭毛へのマイクロ電気穿孔法で注入された蛍光色素の例。

 
 FRAPの速度解析から拡散係数Dを求める場合、いくつかの仮定をおくが、その中に、細胞の形状が無限に大きい、広い、あるいは、じゅうぶんに細長い筒状の構造であると仮定している点がある。これは実際の観察結果に理論式を当てはめるときの都合による。ウニ精子鞭毛は、ちょうどそのような細長い筒状の物体で、一次元の拡散だけが起こると見なせるので、解析の上で大変都合がよい。ところが、FRAPの実験を繰り返すうちに、蛍光強度が回復する速度(半分まで回復する時間、t1/2)をみると、頭部付近の鞭毛基部よりは先端部の方が明らかに長くなる点、別の表現をすると、見かけ上のDが小さくなることに気付いたのである(Fig. 8)。もちろん、物理的な定数が変わるはずはないので、t1/2の上昇は他のことが原因である。私たちは、これを鞭毛先端の細胞膜が自由な拡散を隔てる壁となるためであろうと考えた。Fig. 9に示すように、ウニ精子を小さなセグメントに分割して拡散過程をシミュレーションし、実験結果、つまり、鞭毛先端部での拡散過程の遅れがうまく説明できることがわかったのである[46]。

Table I マイクロ電気穿孔法でウニ精子鞭毛内へ注入を試みた蛍光色素の分子量と注入の効率。


 これで、一つの考え方が証明されたわけではない。間違いとは言えないことが示されたに過ぎないが、繊毛・鞭毛の中の拡散過程を理解するうえで、先端部、基部で状況が変わること、細胞の形状の効果を十分配慮する必要があるこを示唆している。この形状の効果は、0.1〜0.6秒ほどの拡散時間が細胞にとって意味を持つ場合に限って特に重要となるであろう。つまり、一般に拡散速度の速いイオン、細胞膜が障壁とならないガス分子などはまったく問題とはならない。対して、数百の分子量の化合物、ちょうど、ATPや細胞内シグナル伝達に関わる分子が、このような細胞形状の影響を直接受けることになると想像している。
Fig.8 ウニ精子鞭毛のFRAP実験における蛍光強度回復時間(t1/2)の場所による違い。横軸は鞭毛基部からの距離(μm)。


Fig.9 ウニ精子鞭毛内での拡散過程をシミュレーションするモデル。鞭毛は立方体のセグメントが一列に連結したものと見なした。


 このような細胞内拡散と繊毛・鞭毛機能に関する解析から、数十μmが長さの限界となる点で、ATP供給速度に関する議論はほぼ決着がついたと考えている。そこから、探究すべき次の3つの課題が生まれる。このような研究から、精子のエネルギー供給問題を、動物は進化の上でどのように解決してきたのか、生殖戦略の多様性への理解につながることを期待している。これから起こる人間社会へのエネルギー供給問題に関しては、人類がより賢い進化をすることを祈りつつ。

・長さの長い鞭毛は、エネルギー問題を解決する上で、他のどのような手段を進化させたか。これは哺乳類精子やショウジョウバエの精子が、よいヒントとなるであろう。

・エネルギー問題を解決できた精子にとっての最適な鞭毛長はどのような因子で決まるのか。単に運動効率や遊泳速度できまるのか、あるいは、生殖戦略上の他の因子が同時にはたらき、精子形状の多様化へとつながったのか。

・エネルギー問題を解決できずに、しかも、長さの長い精子鞭毛を持つ生物はいるのか。そのような動物は、他にどのような対処や妥協を行っているか。
 
 この一連の研究で、実験材料を提供いただいた東京大学大学院理学系研究科附属臨海実験所(アカウニ)、お茶の水女子大学湾岸生物教育研究センター(バフンウニ)、真鶴ふみ丸の松沢氏(ムラサキウニ)に、また、ガラス電極作成法のご指導いただいた吉村氏、マイクロ電気穿孔法技術の指導いただいた阿部・岡両氏に、この場を借りて感謝申し上げたい。


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